Evaluación de herramientas de modificación genética para el estudio de la proteína tgcep120 en Toxoplasma gondii

Abstract

El parásito protozoo Toxoplasma gondii afecta a una gran parte de la población mundial y, aunque no suele ser mortal para personas saludables, puede ser perjudicial para aquellos con sistemas inmunológicos debilitados. El ciclo de vida del parásito es complejo y abarca múltiples huéspedes, lo que lo convierte en un modelo de investigación valioso. Su fácil manipulación lo convierte en un gran modelo para los apicomplejos. La microscopía confocal y la superresolución están revolucionando la visualización de estructuras biológicas, ofreciendo imágenes 3D claras y detalladas de moléculas. Este trabajo final de carrera se centró en evaluar la eficacia de integrar ADN externo en el genoma de T. gondii utilizando CRISPR/Cas9 en una cepa que carece del gen Ku80. Se diseñó una secuencia de ARN guía para CRISPR y se generó un cassette de inserción con resistencia y etiquetas para marcado. La transfección de parásitos se realizó mediante electroporación y nucleoporación, seguida de cultivo en células. Los resultados se evaluaron mediante técnicas como inmunofluorescencia indirecta (IFI) y PCR. Aunque la IFI mostró resultados prometedores al detectar la proteína marcada, los intentos de confirmación mediante PCR resultaron negativos. Se propuso una posible falla en el funcionamiento de CRISPR/Cas9 como explicación. Además, se realizó un análisis comparativo de técnicas de microscopía, concluyendo que la confocal con Airyscan mejoró significativamente la resolución de imágenes, mientras que el método DNA-PAINT no ofreció mejoras significativas. También se exploró el potencial de técnicas de microscopía para lograr una localización precisa de etiquetas en las estructuras celulares, resaltando la mejora de la confocal con Airyscan en comparación con DNA-PAINT. Estos hallazgos contribuyen al entendimiento de los desafíos y oportunidades en la investigación de parásitos como T. gondii y la aplicación de tecnologías genéticas y de imagen.