Obtención y caracterización de nueva línea celular recombinante productora de TNF-alfa

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dc.contributor.advisorMulet Navarro, Ana Paula
dc.contributor.advisorIbarburu Fernandez, Sofía
dc.contributor.tribunalTiscornia Roble, María Inés
dc.contributor.tribunalPerelmuter Schein, Karen
dc.creatorSalvador Sosa, Tamara
dc.date.accessioned2024-07-11T15:58:16Z
dc.date.available2024-07-11T15:58:16Z
dc.date.issued2024
dc.descriptionIncluye bibliografía y anexos.
dc.description.abstractEn este trabajo final de carrera se propone obtener una línea celular recombinante estable productora de TNF-α. El factor de necrosis tumoral (TNF-α) es una proteína de la familia de las citoquinas producida por varios tipos de células, principalmente por macrófagos y fibroblastos. Ha sido identificado como un importante regulador de las respuestas inflamatorias y desempeña un papel primordial en la patogénesis de algunas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Es por esto que la producción de anticuerpos monoclonales anti-TNF-α, se utilizan para el tratamiento de estas enfermedades. Para su síntesis, se necesita inmunizar a un animal con un antígeno específico, como TNF-α humano. Se necesita un método para producir esta proteína de forma sintética manteniendo su estructura lo más similar posible a la humana. Para esto, se optó por la línea celular HEK-293 debido a su disponibilidad en el laboratorio y su eficacia en transfecciones estables. Inicialmente, se amplificó la secuencia codificante de TNF-α a partir de ADNc de células HeLa y se intentó ligar con plásmidos pcDNA3.1 y pGEM®-T sin éxito. Posteriormente, se adquirió el plásmido pcDNA3.1(+) que incluye la secuencia codificante de TNF-α. Con este último plásmido se transformaron bacterias Escherichia coli y se seleccionaron mediante colony PCR con primers específicos. Para obtener la línea celular HEK-293 recombinante se transfectaron células HEK-293 con el plásmido pcDNA3.1(+)+TNF-α y durante dos semanas se seleccionaron con el antibiótico G418. Se establecieron, por un lado, una línea policlonal, y por otro, cuatro líneas monoclonales mediante la técnica de dilución limite. Se caracterizó el crecimiento de la línea policlonal en comparación con las células sin transfectar. Se confirmó la presencia del CDS de TNF-α en todas las líneas obtenidas a través de PCR a partir del ADN genómico. Se realizó el estudió de la expresión de TNF-α mediante qPCR a partir del ADNc de los 4 clones estudiados y se observó que expresan entre 110 y 480 veces más que la línea no transformada. El estudio de la expresión proteica mediante western blot permitió detectar esta citoquina en el sobrenadante de la línea policlonal crecida en ausencia de presión selectiva. Este estudio proporciona una base sólida para futuras investigaciones sobre TNF-α y su aplicación en terapias contra enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
dc.format.extent81 p. il., grafs.
dc.format.mimetypePDF
dc.identifier.citationSalvador Sosa, T. (2024). Obtención y caracterización de nueva línea celular recombinante productora de TNF-alfa (Trabajo final de carrera). Universidad ORT Uruguay, Facultad de Ingeniería. Recuperado de https://rad.ort.edu.uy/handle/20.500.11968/7009
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/20.500.11968/7009
dc.languagespa
dc.publisherUniversidad ORT Uruguay
dc.relation.otherhttps://sisbibliotecas.ort.edu.uy/bib/95862
dc.rights.levelAcceso abierto
dc.subjectPROYECTOS-BI
dc.subjectLÍNEA CELULAR RECOMBINANTE
dc.subjectCULTIVO CELULAR
dc.subjectCARACTERIZACIÓN
dc.subjectPROTEÍNAS
dc.titleObtención y caracterización de nueva línea celular recombinante productora de TNF-alfa
dc.typeTrabajo final de carrera
dc.type.versionVersión publicada
ort.thesis.careerFI - Ingeniería en Biotecnología - BI
ort.thesis.degreegrantorFacultad de Ingeniería
ort.thesis.degreelevelCarrera universitaria
ort.thesis.degreenameIngeniera en Biotecnología
ort.thesis.degreetypeTrabajo final de carrera
ort.thesis.noteTrabajo final de carrera (Carrera Universitaria). Universidad ORT Uruguay, Facultad de Ingeniería
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