Browsing by Author "Dalies Sena, Malena"

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    Expansión de herramientas moleculares para expresión de proteínas en Gluconobacter
    (Universidad ORT Uruguay, 2023) Dalies Sena, Malena; Mulet Navarro, Ana Paula; Pirotti Corrales, Florencia Daniela; Díaz Viraque, Florencia
    El presente trabajo final de carrera llevó a cabo una búsqueda de antecedentes del uso de promotores en Gluconobacter y géneros relacionados. Se encontró el promotor constitutivo J23104, exitosamente utilizado en acetobacterias para inducir la expresión de un gen reportero; los promotores constitutivos p2703 y pB932_2000, para G. oxydans WSH-003; y el promotor inducible pBAD. Además, se generaron dos promotores nuevos para G. oxydans utilizando herramientas bioinformáticas. Mediante un análisis del genoma de Gluconobacter oxydans NBRC 14819 utilizando el software PePPER y la creación de un programa para obtener secuencias consenso se diseñaron los promotores pMD108 y pMD110. A partir de estos enfoques se generó una librería de promotores candidatos para G. oxydans y G. frateurii. En paralelo, se utilizaron herramientas de biología molecular para diseñar una estrategia de evaluación experimental de la librería de promotores. Esto implicó el diseño in silico y construcción de vectores backbone conteniendo el gen reportero mCherry, regulado por un promotor que se encuentra flanqueado por dos sitios de restricción, y un cassette de resistencia a antibiótico como marcador de selección. Se realizó una puesta a punto de metodologías de evaluación de la expresión del gen reportero. Se desarrolló un protocolo de lectura de la emisión de fluorescencia en un lector de placas, sumado a la observación de la señal fluorescente por microscopía confocal. Estas metodologías resultaron exitosas para diferenciar la expresión de la proteína entre las cepas tipo salvaje, las cepas conteniendo el plásmido backbone, y las cepas conteniendo el plásmido backbone sin mCherry.