Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos

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Date
2019
Authors
Elenter Litwin, Nicole
Publisher
Universidad ORT Uruguay
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Abstract
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y los genes asociados a CRISPR (Cas) son elementos esenciales del sistema inmune adaptativo de algunas bacterias y arqueas, al intervenir en la eliminación de material exógeno invasor. El sistema tipo II de CRISPR es la herramienta más utilizada para la edición génica, permitiendo la obtención de diversos modelos animales. El ratón de laboratorio (Mus musculus) es el animal de investigación por excelencia. La generación de modelos murinos genéticamente modificados mediante la técnica de CRISPR implicaba necesariamente la microinyección de material exógeno en los ovocitos. Esta técnica presenta ciertas desventajas: personal altamente calificado, un trabajo laborioso y lento, causando la muerte de la mitad de los embriones. Como alternativa a la microinyección surge la electroporación. Esta implica la generación de poros en la membrana de los cigotos mediante la aplicación de pulsos cortos. A diferencia de la microinyección, la electroporación se caracteriza por su simpleza, rapidez y costos de producción bajos. Durante este trabajo se efectuó la puesta a punto de un protocolo para la generación de embriones genéticamente modificados mediante la electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos. En primer lugar, se optimizó el tiempo de tratamiento con ácido tirodes (AT) de los cigotos. Con una solución de AT, se degradó un porcentaje de la zona pelúcida lo suficientemente alto para permitir el ingreso de las RNPs, sin ir en desmedro del desarrollo del embrión. Además, se determinó el protocolo óptimo para la generación de embriones knockout (KO) del gen Clec4F. Las condiciones óptimas seleccionadas fueron electroporaciones de 10 pulsos de 30V, con una duración de 3ms y un intervalo entre pulsos de 100ms, y concentraciones de RNPs de 250ng/μl de proteína Cas9 y 300ng/μl 5 de sgRNA. Estas condiciones fueron determinadas con embriones de la cepa híbrida de ratones B6D2F1/J, obteniéndose un desarrollo a blastocisto de 16,4% y una de eficiencia de mutación de 70,0%. Se probó que este protocolo es válido para generar embriones KO para el mismo gen en la cepa consanguínea de ratones C57BL/6J. Se obtuvo para esta cepa un porcentaje de desarrollo a blastocisto de 6,5% y una eficiencia de mutación de 85,7%. Por último, se intentó insertar un sitio loxP en embriones de la cepa híbrida. Si bien no se obtuvo una alta eficiencia de knockin (KI), se lograron resultados de desarrollo y eficiencia de mutación de KO de 41,1% y 100,0% respectivamente.
En
Thesis note
Trabajo final de carrera (Carrera Universitaria). Universidad ORT Uruguay, Facultad de Ingeniería
Thesis degree name
Ingeniera en Biotecnología
103 p. il., diagrs., fot.
Notes
Incluye bibliografía.
Subject
ANIMALES, EMBRIÓN, LABORATORIOS, PROYECTOS-BI
Type
Trabajo final de carrera
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Citation
Elenter Litwin, N. (2019). Electroporación de CRISPR-Cas9 en cigotos murinos (Trabajo final de carrera). Universidad ORT Uruguay, Facultad de Ingeniería. Recuperado de https://rad.ort.edu.uy/handle/20.500.11968/4081
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