Ingeniería de proteínas para elucidar el mecanismo de glutarredoxinas

Abstract

En el presente proyecto, se utilizaron técnicas de ingeniería de proteínas y enzimología para abordar las bases estructurales y cinéticas de las diferencias entre glutarredoxinas (Grx) de clase I y clase II. En base a comparación de secuencias y estructuras, se generaron variantes con mutaciones puntuales o intercambiando elementos de secuencia para convertir Grx de clase I en clase II y viceversa. Adicionalmente, se generaron versiones “humanizadas” de Grx de tripanosomas con el objetivo de analizar los determinantes estructurales de la selectividad por tripanotión. Las proteínas se expresaron y purificaron mediante cromatografía de afinidad y se evaluó la pureza mediante electroforesis desnaturalizante, espectrometría de masa y cromatografía de exclusión molecular analítica. La actividad reductasa de las diferentes variantes se determinó mediante ensayos estándar de actividad Grx (reducción de disulfuro mixto entre GSH y β-mercaptoetanol) y tiorredoxina (reducción de insulina), mientras que la reacción con oxidantes se estudió por espectroscopía de fluorescencia. Por lo tanto, se aportó a la comprensión del mecanismo de Grx, el cual es relevante para entender la biología de estas proteínas. Se confirmó que las Grx de clase II estudiadas son inactivas en el ensayo HED mientras que las de clase I son activas. Los experimentos con versiones ingenierizadas demostraron que la estructura en torno al sitio activo (cercana en secuencia y en el espacio) es esencial para la actividad de las Grx de clase I.