Estudio de características biofísicas de la cilia relacionadas a la regulación del transporte de proteínas al organelo

Abstract

La cilia primaria es un organelo celular que se extiende desde la superficie celular, que comunica la célula con su entorno ya que su membrana contiene receptores de importantes vías de señalización. No se conocen con exactitud los mecanismos por los cuales se clasifican y transportan las proteínas a la cilia. En la base de la cilia se encuentra una región denominada zona de transición (ZT) que cumple una función de barrera entre el interior de la cilia y el citosol, así como también entre la membrana ciliar y la membrana plasmática. El objetivo de este trabajo final de carrera es estudiar características biofísicas de la cilia y de la ZT, tales como la fluidez de la membrana y el hacinamiento molecular, que podrían contribuir en la función de barrera. Para analizar estas características biofísicas se utilizaron las sondas LAURDAN y ACDAN. Estas sondas tienen la capacidad de cambiar su espectro de emisión según las características del microambiente en el que se encuentren. Se trabajó con células NIH/3T3 que expresan de forma estable proteínas de la cilia y ZT marcadas con etiquetas (Sstr3-Snap y B9D1-Halo, respectivamente) que permiten localizar ambas regiones en microscopía de fluorescencia. Mediante el uso de microscopía hiperespectral y el análisis de las imágenes usando gráficos de fasores, se evaluaron los cambios en los espectros de emisión de LAURDAN y ACDAN. Se demostró que en la ZT la fluidez de la membrana es menor que en el cuerpo de la cilia y el hacinamiento molecular es mayor. También se relacionaron estas características biofísicas con la funcionalidad de la ZT y la composición de fosfoinosítidos de la membrana ciliar, usando células con estas características alteradas: MEFs ko para una proteína de la ZT (Tmem231) o para la fosfatasa ciliar que convierte el PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(4)P en la cilia. Se generaron líneas que expresan de forma estable el marcador ciliar Arl13b-Halo. No se encontraron diferencias en la fluidez de la membrana de las cilias de estas células en comparación con cilias de células wt. En el futuro se buscará marcar en las mismas células la ZT para evaluar si existen cambios en la fluidez de la membrana en esta región en particular.