Von hippel lindau tumour suppressor protein production as a tool for the evaluation of anticancer molecules

Abstract

El objetivo del siguiente trabajo final de carrera es estudiar el proceso de agregación amiloide de la proteína supresora de tumores von Hippel-Lindau (pVHL), que está implicada en varias enfermedades hereditarias y desarrollo tumoral. Estas moléculas se utilizaron en estudios anteriores para otras proteínas amiloidogenicas y se ha demostrado que inhiben la agregación, por lo que se probaran para VHL. Los experimentos se llevaron a cabo con VHL Wt y dos mutantes: R167W y P86L. Primero, las proteínas se expresaron con éxito en Escherichia coli BL21 utilizando el plásmido pET14b que contiene el gen objetivo. Posteriormente, se realizó un estudio del proceso de purificación utilizando dos estrategias: cromatografia Ni-NTA y Ni-IDA. Sin embargo, el método Ni-NTA mostró mayores rendimientos de pureza y eficiencia, obteniendo un 69% de pureza y un rendimiento de 1.9 mg de proteína / g de pellet para VHL Wt. A continuación, se realizó una diálisis para lograr el replegamiento de VHL. Además, se realizó una cromatografía de exclusión molecular en un FPLC para VHL Wt como paso analítico, pero los resultados sugieren que podría añadirse como un paso de purificación. Por último, se realizaron diversas pruebas bioquímicas, incluyendo Thioflavin-T, Congo Red y turbidez, en presencia y ausencia de NQTrp y EGCG. Los resultados indican la inhibición de la agregación en presencia de ambas moléculas probadas; sin embargo, sigue siendo inconcluso determinar cuál molécula inhibe la agregación de manera más efectiva. Este proyecto sirvió como una primera aproximación para comprender mejor los inhibidores de agregación, abriendo un amplio rango de futuras investigaciones para desarrollar un fármaco terapéutico para el síndrome von Hippel-Lindau.