Diseño y puesta a punto de un sistema de diagnóstico de PCR en tiempo real para las mutaciones en los genes que codifican para Factor II, Factor V y Metilentetrahidrofolato reductasa

Abstract

En el presente trabajo se procedió a diseñar y poner a punto un sistema de diagnóstico de detección y genotipado de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) C677T, G20210A y G1691A, utilizando la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (Real-Time PCR). Para lograr tal objetivo se diseñaron tres juegos de primers en el que cada uno amplifica un fragmento que contiene el SNP. A su vez, se seleccionaron y diseñaron sondas específicas de secuencia denominadas TaqMan marcadas con distintos fluoróforos. Se diseñaron dos sondas por SNP evaluado, donde cada par contiene la misma secuencia exceptuando un solo nucleótido correspondiente al SNP. La fluorescencia emitida por cada fluoróforo es proporcional a la cantidad de producto específico de ADN amplificado. Por otro lado, la puesta a punto de la PCR en Tiempo Real se realizó en las plataformas ABI Prism® 7500 (Applied Biosystems), a partir de ADN genómico obtenido por tres métodos de extracción diferentes y en el equipo Rotor-Gene™ (Corbett) mediante un solo método. Estos métodos se compararon en cuanto a calidad y cantidad de ADN obtenido, versatilidad, sencillez, tiempo de procesamiento y costos.