Browsing by Author "Pirotti Corrales, Florencia Daniela"

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    Bioproducción de enzimas terapéuticas para su incorporación en nanopartículas
    (Universidad ORT Uruguay, 2024) Saravia Silvera, Evangelina; Vila Varela, Delfina; Ortiz Carrión, Cecilia Carolina; Jackson Carvalho, Erienne; Pirotti Corrales, Florencia Daniela
    En el siguiente trabajo final de carrera se expresan dos enzimas terapéuticas claves para el tratamiento del cáncer: la CD y la UPRT, en cuatro cepas de expresión diferentes provenientes de Escherichia coli. Estas dos enzimas se presentan como candidatos terapéuticos para desarrollar estrategias dirigidas a sitios específicos en el cuerpo afectados por el cáncer, para poder así aumentar la efectividad y reducir los efectos adversos. Recientes avances en genómica, proteómica y biología molecular han permitido la expresión de proteínas heterólogas en sistemas biológicos. La cepa bacteriana Escherichia coli se destaca como un sistema de expresión, debido al amplio conocimiento con respecto a su metabolismo, fisiología y genética, así como a la gran variedad disponible de vectores para la producción de proteínas recombinantes con costos reducidos y alta eficiencia. La evaluación de estas permitió identificar a la cepa BL21(DE3) como el mejor sistema de expresión para escalar satisfactoriamente la expresión. Las proteínas terapéuticas presentaron un elevado grado de pureza, mayor a 90%, luego de dos pasos cromatográficos que incluyeron una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos y una cromatografía de exclusión molecular. Además, se colectó información novedosa con respecto a la conformación oligomérica en solución de las enzimas. Finalmente, en esta tesis se generaron inmovilizados activos conteniendo una variante mejorada de CD, CD_S126R, por atrapamiento en sílica biomimética. Los mismos presentaron un porcentaje de inmovilización y rendimiento del 96% y 55%, respectivamente. Los datos recuperados resultan alentadores para continuar avanzando hacia una estrategia terapéutica combinada, basada en el par CD/UPRT.
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    Co-cultivos de microalgas y levaduras para la revalorización de aguas residuales hidropónicas
    (Universidad ORT Uruguay, 2023) Rocha Calvette, Facundo Serafín; Nervi Faggiani, Eliana; Umpiérrez Failache, Mariana; Pirotti Corrales, Florencia Daniela; Zinola García, Oscar Guillermo
    El presente trabajo final de carrera tiene por objetivo el diseño y evaluación de co-cultivos entre microalgas y levaduras para la generación de productos de interés, utilizando como fuente de nutrientes aguas residuales hidropónicas y potencialmente otro tipo de desechos. Se llevó a cabo un “screening” de microalgas y levaduras oleaginosas capaces de crecer en el efluente. Se demostró que el efluente es un medio rico para el crecimiento de microalgas, logrando crecerse exitosamente seis aislamientos, siendo este el primer reporte de crecimiento en aguas residuales hidropónicas para tres de ellas: Choricystis minor, Chlamydomonas reinhardtii y Spirulina platensis. Se reporta la mayor cantidad de biomasa obtenida para Chlorella spp. en este tipo de efluente y en modalidad autotrófica, heterotrófica y mixotrófica hasta el momento. A su vez, se identificó una cepa de Rhodotorula spp. capaz de crecer en la solución en presencia de glucosa. A partir de estos dos organismos y una segunda microalga (C. minor), se diseñaron co-cultivos, identificándose sinergismos al crecer a cada microalga con la levadura en relación 1:1. Una vez escalados y crecidos en autotrofia, los posibles co-cultivos fueron evaluados en la producción de biomasa, lípidos y carotenoides, seleccionando al de mejores rendimientos para establecer sistemas heterotróficos y mixotróficos empleando glucosa como fuente de carbono. El co-cultivo entre Chlorella spp. y Rhodotorula spp. demostró aumentar la producción de biomasa respecto a los controles en todas las modalidades tróficas evaluadas, obteniéndose biomasas totales de 1.38, 2.67 y 2.08 g.L-1 en autotrofia, heterotrofia y mixotrofia respectivamente. También se observó un aumento significativo en la producción lipídica al crecer ambas especies en modalidad autotrófica. Respecto a la producción de carotenoides, la misma se ve favorecida por el co-cultivo de C. minor y Rhodotorula spp. Tanto los rendimientos de lípidos como de carotenoides fueron bajos comparados con valores de bibliografía para otros medios, probablemente por el exceso de nitrógeno y fósforo en el medio, concluyéndose que el mismo no es el ideal para la obtención de dichos metabolitos. Aun así, la biomasa obtenida podría tener potencial uso como biofertilizantes, así como suplementos y alimento animal. Como aspecto de la biorremediación en la cual se enfoca el proyecto, se logró una remoción del 84 % del fósforo total en el sistema autotrófico y un 98,20 % de los nitratos en el sistema heterotrófico.
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    Expansión de herramientas moleculares para expresión de proteínas en Gluconobacter
    (Universidad ORT Uruguay, 2023) Dalies Sena, Malena; Mulet Navarro, Ana Paula; Pirotti Corrales, Florencia Daniela; Díaz Viraque, Florencia
    El presente trabajo final de carrera llevó a cabo una búsqueda de antecedentes del uso de promotores en Gluconobacter y géneros relacionados. Se encontró el promotor constitutivo J23104, exitosamente utilizado en acetobacterias para inducir la expresión de un gen reportero; los promotores constitutivos p2703 y pB932_2000, para G. oxydans WSH-003; y el promotor inducible pBAD. Además, se generaron dos promotores nuevos para G. oxydans utilizando herramientas bioinformáticas. Mediante un análisis del genoma de Gluconobacter oxydans NBRC 14819 utilizando el software PePPER y la creación de un programa para obtener secuencias consenso se diseñaron los promotores pMD108 y pMD110. A partir de estos enfoques se generó una librería de promotores candidatos para G. oxydans y G. frateurii. En paralelo, se utilizaron herramientas de biología molecular para diseñar una estrategia de evaluación experimental de la librería de promotores. Esto implicó el diseño in silico y construcción de vectores backbone conteniendo el gen reportero mCherry, regulado por un promotor que se encuentra flanqueado por dos sitios de restricción, y un cassette de resistencia a antibiótico como marcador de selección. Se realizó una puesta a punto de metodologías de evaluación de la expresión del gen reportero. Se desarrolló un protocolo de lectura de la emisión de fluorescencia en un lector de placas, sumado a la observación de la señal fluorescente por microscopía confocal. Estas metodologías resultaron exitosas para diferenciar la expresión de la proteína entre las cepas tipo salvaje, las cepas conteniendo el plásmido backbone, y las cepas conteniendo el plásmido backbone sin mCherry.
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    Nanobiosensor colorimétrico para la detección de toxina épsilon de Clostridium perfringens Tipo D
    (Universidad ORT Uruguay, 2017) Pirotti Corrales, Florencia Daniela; Rodríguez Ferreira, Joaquín Santiago; Betancor Dutrenit, Lorena; Sanguinetti Acosta, Carlos Julio; Mendez Morales, Eduardo Daniel
    La toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D (etx) es uno de los principales antígenos implicados en la enterotoxemia de animales domésticos y una de las infecciones que más afecta al ganado. El principal método de profilaxis es la utilización de vacunas veterinarias. Para su elaboración se realizan fermentaciones industriales de la bacteria C. perfringens. La mejora de las metodologías para la preparación de las vacunas como en la estandarización de puntos críticos, mejoraría la calidad y aumentaría el rendimiento de tales procesos. Para esto se busca una metodología rápida que permita analizar y cuantificar la etx, para reducir tiempos y disminuir el capital invertido en testeo y pruebas in vivo. Un nanobiosensor permite la detección y/o cuantificación de un analito de interés de manera inmediata utilizando interacciones biológicas que luego son transducidas mediante un transductor para que puedan ser leídas por el usuario. En este trabajo, se busca el desarrollo de un nanobiosensor basado en nanopartículas de oro, capaz de generar un cambio colorimétrico según la concentración de toxina épsilon a la que se lo enfrente, logrando implementar un control en la fermentación de C. perfringens para la producción de vacunas veterinarias mediante el seguimiento a pie de reactor de la concentración producida de etx, optimizando así los tiempos de fermentación y estandarizando la concentración final de cada batch. Con el protocolo óptimo de preparación y tras desafiar el nanobiosensor con muestras puras de etx, se obtuvo una respuesta que implicó un cambio colorimétrico de la suspensión de nanopartículas proporcional a la concentración de etx en relaciones molares de nanopartículas:etx de 1:100.
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    Producción y purificación de dihidroxiacetona y ácido glicérico obtenidos a partir de la biotransformación de glicerol
    (Universidad ORT Uruguay, 2023) Córdoba Quintero, Ana Cecilia; Ripoll Pérez, Magdalena; Mulet Navarro, Ana Paula; Pirotti Corrales, Florencia Daniela
    El presente trabajo final de carrera tiene como objetivo evaluar posibles mejoras en los procesos de producción y purificación de DHA y GA, obtenidos a partir de la biotransformación de glicerol por bacterias mutantes y Wild Type (WT) del género Gluconobacter. Se investigó el potencial de las bacterias del género Gluconobacter para producir compuestos químicos de interés para la industria cosmética y farmacéutica, como la dihidroxiacetona (DHA) y el ácido glicérico (GA). Para aumentar la producción de GA se utilizaron herramientas de biología molecular para sobreexpresar la subunidad III de mADH (AdhS). Partiendo de construcciones previas del grupo de investigación de Tecnología de Proteínas de la Universidad ORT Uruguay, se logró obtener mutantes de G. frateurii (Gfr) y G. oxydans (Gox). Estas cepas mutantes fueron evaluadas en la conversión de glicerol a GA y DHA, utilizando células en crecimiento y en reposo. Además, se estudió el crecimiento de la cepa Gfr WT en un fermentador con y sin control de pH, con el objetivo de determinar si se podía aumentar los rendimientos de biomasa y establecer las mejores condiciones para la producción de GA. Finalmente, se exploraron alternativas para la purificación de los compuestos GA y DHA obtenidos a partir de la oxidación del glicerol. Aunque se logró obtener un producto de GA con menor presencia de contaminantes, los rendimientos aún no alcanzan niveles relevantes a nivel industrial. Sin embargo, se obtuvo una solución concentrada de DHA adecuada para su uso en formulaciones cosméticas.